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如何制作動物染色體標(biāo)本

更新時間:2013-10-24      點(diǎn)擊次數(shù):3871

    細(xì)胞處于活躍的增值狀態(tài)或者通過人工的各種處理后,細(xì)胞進(jìn)入分裂的動物組織科用于染色體的分析。由于在正常的動物骨髓內(nèi),細(xì)胞是處于不斷分裂的,給其注射一定的秋水仙堿可以讓許多細(xì)胞處于分裂的細(xì)胞停在細(xì)胞分裂中期,然后采用常規(guī)空氣干燥法制備染色體,即可得到大量可分析的染色體標(biāo)本。

    實(shí)驗(yàn)用品

  一、 材料

  小白鼠

  器材

  水平離心機(jī)、顯微鏡、刻度離心管(10ml)、注射器(1ml)、載玻片、燒杯(400ml)、量筒(100ml)、試管架、鑷子、剪刀、解剖刀、吸管。

  二、 試劑

  1. 2%檸檬酸鈉溶液:稱取2g檸檬酸鈉(檸檬酸三鈉,Tri-sodium citrate, AR)溶解于100ml蒸餾水中。

  2. 1%檸檬酸鈉溶液。

  3. 500μm/ml、100mg/ml秋水仙素溶液。

  4. Giemsa(姬姆薩)原液(pH6.8)

  Giemsa染粉 1g

  甘油(丙三醇,glycerine, AR) 33ml

  甲醇(methyl alcoholA, AR) 45ml

  將染粉傾入乳缽,加幾滴甘油,在乳缽內(nèi)研磨直到無顆粒為止,此時再將全部剩余甘油倒入,放入60~65℃保溫箱中保溫2h后,加入甲醇攪拌均勻,保存于棕色瓶中備用。

  5. 0.067mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)

  Na2HPO4·12H2O11.81g

  (或Na2HPO4·2H2O 5.92g)

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 ?、?小白鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備方法

  實(shí)驗(yàn)方法

  1.動物按4μg/g體重的劑量經(jīng)腹腔注射秋水仙素,3~4h后殺死動物。

  2.取出動物后肢的脛骨和股骨。剪去兩端。

  3.將0.6~1ml 2%檸檬酸鈉用1ml注射器接上5#針頭注入骨髓腔,將骨髓細(xì)胞先沖入小碟取下注射器針頭,反復(fù)吸打骨髓細(xì)胞,使細(xì)胞團(tuán)塊分散,轉(zhuǎn)入10ml離心管。

  4.視骨髓量之多寡加入0.4%KCl溶液8~10ml,隨即將離心管置37±0.5℃水浴中低滲15~20min

  5.以1000r/min離心8min

  6.棄上清液,沿離心管壁緩慢加入新配制的甲醇:冰醋酸(3:1)固定液5ml,加固定液時注意不要沖動細(xì)胞團(tuán)塊。

  7.加完固定液后,立即用吸管將細(xì)胞輕輕吸打均勻,靜置固定20min。如此反復(fù)固定2~3次,每次20min。

  8.固定的細(xì)胞經(jīng)離心后,吸取上層固定液,視管底的細(xì)胞多寡加入少量新配制的固定液,將細(xì)胞團(tuán)塊輕輕吸打成懸液。

  9.在干凈、濕、冷的載玻片上滴2~3滴上層細(xì)胞懸液,在酒精燈上文火烘干(在空氣干燥的地方可不用)。

  10.將玻片標(biāo)本平放于支架上,細(xì)胞面朝上,每片滴加1:100 Giemsa磷酸鹽緩沖液3~4ml,染色10min。

  11.在自來水管下細(xì)流沖洗數(shù)秒,去掉Giemsa磷酸鹽緩沖液,用小塊紗布擦干玻片標(biāo)本底面和四周,顯微鏡觀察和分析。

  通過以上步驟就制備出可以進(jìn)行觀察的小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本,用相應(yīng)的顯微鏡及可進(jìn)行觀察實(shí)驗(yàn)。

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